University of Oulu

Protein crystallography of triosephosphate isomerases: functional and protein engineering studies

Saved in:
Author: Alahuhta, Markus1,2
Organizations: 1University of Oulu, Faculty of Science, Department of Biochemistry
2University of Oulu, Biocenter Oulu
Format: ebook
Version: published version
Access: open
Online Access: PDF Full Text (PDF, 7.8 MB)
Persistent link: http://urn.fi/urn:isbn:9789514287909
Language: English
Published: 2008
Publish Date: 2008-05-06
Thesis type: Doctoral Dissertation
Defence Note: Academic dissertation to be presented, with the assent of the Faculty of Science of the University of Oulu, for public defence in Raahensali (Auditorium L10), Linnanmaa, on May 16th, 2008, at 12 noon
Reviewer: Doctor Tiina Salminen
Professor Elisabeth Sauer-Eriksson
Description:

Abstract

The aim of this PhD-study was to better understand the structure-function relationship of triosephosphate isomerase (TIM) and to use this expertise to change its substrate specificity. TIM is an important enzyme of the glycolytic pathway which catalyzes the interconversion of D-glyceraldehyde phosphate (D-GAP) and dihydroxyacetone phosphate (DHAP). Two main subjects are discussed: the engineering of monomeric TIM to create new substrate specificity and the structure-function relationship studies of the catalytically important mobile loop6.

The starting point for the protein engineering project was the monomeric ml8bTIM, with an extended binding pocket between loop7 and loop8. Rational protein engineering efforts have resulted in a new variant called A-TIM that can competently bind wild type transition state analogues. A-TIM was also able to bind citrate, a compound that the wild type TIM does not bind. This A-TIM citrate complex structure is a good starting point for future protein engineering efforts.

Based on the assumption that it would be beneficial for the monomeric forms of TIM to have loop6 closed permanently to increase the population of competent active sites, two point mutation variants, A178L and P168A were generated and characterized. The A178L-mutation was made to favor the closed conformation of loop6 through steric clashes in the open conformation. The P168A variant was made to stabilize the closed conformation of loop6 by removing strain. The A178L mutation induced some features of the closed conformation, but did not result in a closed conformation in the absence of ligands. Our structural studies also show that the P168A mutation does not favor the closed conformation either. However, the structures of the unliganded and liganded P168A variant, together with other known TIM structures show that the substrate binding first induces closure of loop7. This conformational switch subsequently forces loop6 to adopt its closed conformation.

The protein engineering project was successful, but the efforts to find variants with a permanently closed loop6 did not fully succeed. In the context of this thesis a monomeric variant of TIM, with new binding properties, was created. Nevertheless, A-TIM still competently binds the inhibitors and transition state analogues of wild type TIM. Also, when combined, results discussed in the context of this thesis indicate that in wild type TIM the closure of loop7 after ligand binding is the initial step in the series of conformational changes that lead to the formation of the competent active site.

see all

Tiivistelmä

Tämän väitöskirjatyön tarkoituksena oli oppia paremmin ymmärtämään trioosifosfaatti-isomeraasin (TIM) toimintamekanismeja sen rakenteen perusteella ja käyttää tätä tietämystä samaisen proteiinin muokkaamiseen uusiin tarkoituksiin. TIM on keskeinen entsyymi solun energian tuotannossa ja sen toiminta on välttämätöntä kaikille eliöille. Tämän vuoksi on tärkeää oppia ymmärtämään miten se saavuttaa tehokkaan reaktionopeutensa ja miksi se katalysoi vain D-glyseraldehydi-3-fosfaattia (D-GAP) ja dihydroksiasetonifosfaattia (DHAP).

TIM:n toiminta mekanismien ymmärtämiseksi sen aminohapposekvenssiä muokattiin kahdesta kohtaa (P168A ja A178L) ja seuraukset todettiin mittaamalla tuotettujen proteiinien stabiilisuutta optisesti eri lämpötiloissa ja selvittämällä niiden kolmiulotteinen rakenne käyttäen röntgensädekristallografiaa. Mutaatioita tehtiin dimeeriseen villityypin TIM:in (wtTIM) ja jo aikaisemmin muokattuun monomeeriseen TIM:in (ml1TIM). Näiden mutaatioiden tarkoituksena oli suosia entsyymin aktiivista konformaatiota, jossa reaktion kannalta välttämätön vapaasti liikkuva peptidisilmukka numero 6 on suljetussa konformaatiossa. Monomeerisissä TIM:ssa peptidisilmukka numero 6:n ei ole välttämätöntä aueta.

Tulokset mutaatiokokeista olivat osittain lupaavia. P168A-mutaatio lisäsi D-GAP:in sitoutumista, mutta rikkoi tärkeän mekanismin suljetussa, ligandia sitovassa, konformaatiossa. A178L-mutaatio aiheutti muutoksia avoimeen konformaatioon ja teki siitä suljettua konformaatiota muistuttavan jopa ilman ligandia, mutta samalla koko proteiini muuttui epävakaammaksi. Näistä kahdesta mutaatiosta A178L voisi olla hyödyllinen muokattujen TIM-versioiden ominaisuuksien parantamiseksi. Lisäksi yhdessä jo aikaisemmin julkaistujen yksityiskohtien kanssa nämä tulokset tekevät mahdolliseksi esittää tarkennusta siihen miten TIM toimii kun ligandi saapuu sen lähettyville. Tämän väitöskirjatyön yksi tavoite oli myös muokata edelleen monomeeristä TIM versiota (ml8bTIM), joka on suunniteltu siten, että se voi mahdollisesti sitoa uudenlaisia ligandeja. Tämä projekti vaati onnistuakseen 20 eri versiota ml8bTIM:n sekvenssistä ja noin 30 rakennetta. Uusia ligandeja sitova muoto (A-TIM) sitoi onnistuneesti sitraattia ja villityypin TIM:n inhibiittoreita. Erityisen lupaavaa oli, että A-TIM sitoi myös bromohydroksiasetonifosfaattia (BHAP), joka sitoutuu ainoastaan toimivaan aktiiviseen kohtaan. Nämä tulokset osoittavat, että A-TIM kykenee tarvittaessa katalysoimaan isomerisaatio reaktion uudenlaisille molekyyleille. Esimerkiksi katalysoimaan isomerisointireaktiota sokerianalogien tuotannossa.

see all

Series: Acta Universitatis Ouluensis. A, Scientiae rerum naturalium
ISSN-E: 1796-220X
ISBN: 978-951-42-8790-9
ISBN Print: 978-951-42-8789-3
Issue: 508
Subjects:
TIM
Copyright information: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for your own personal use. Commercial use is prohibited.