University of Oulu

Peroxisomal multifunctional enzyme type 2 (MFE-2) : the catalytic domains work as independent units

Saved in:
Author: Haataja, Tatu
Organizations: University of Oulu, Faculty of Science, Department of Biochemistry
University of Oulu, Biocenter Oulu
Format: eBook
Online Access: PDF Full Text (PDF, 9.2 MB)
Persistent link: http://urn.fi/urn:isbn:9789514296062
Language: English
Published: Oulu : University of Oulu, 2011
Publish Date: 2011-11-15
Thesis type: Doctoral Dissertation
Defence Note: Academic dissertation to be presented with the assent of the Faculty of Science of the University of Oulu for public defence in Kuusamonsali (Auditorium YB210), Linnanmaa, on 25 November 2011, at 12 noon
Tutor: Professor Kalervo Hiltunen
Docent Tuomo Glumoff
Reviewer: Docent Tommi Kajander
Doctor Werner Schmitz
Description:

Abstract

Lipids are necessary for living organisms and have various roles as, energy sources, hormone precursors and as components of membrane structures. Fatty acid β-oxidation is a pathway of energy metabolism, in which the fatty acyl-CoAs are degraded in several steps. Peroxisomal β-oxidation systems are found in all eukaryotes studied thus far, but the existence of a mitochondrial system is established in mammals only.

Multifunctional enzyme type 2 (MFE-2) has been characterized from various species and is responsible for catalyzing the second and third steps in the R-specific peroxisomal β-oxidation pathway. MFE-2 accepts a wide range of substrates and displays great variation in domain organization and overall molecular mass. The crystal structures of individual domains of MFE-2 from several species have been determined previously.

In this study, the structural knowledge of MFE-2 is further extended from the domain level to the assembly of the full-length enzyme. The crystal structure of Drosophila melanogaster MFE-2 (DmMFE-2) was solved at 2.15 Å resolution. The enzyme is a homodimer with 3R-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase and 2E-enoyl-CoA hydratase 2 activities residing on each of the polypeptide subunits. Kinetic data combined with information from the structure, suggest that the catalytic domains of DmMFE-2 work as separate entities. It also appears that the enzyme does not assemble into dimers in vitro when the catalytic subunits are introduced in a solution as stand-alone proteins. The data were confirmed by two different methods, static light scattering and small-angle X-ray scattering.

However, the primary use of SAXS was not to monitor the formation of dimers in solution, but instead it was used for structure determination of the human MFE-2. During the process, the structural information from DmMFE-2 was used as a scaffold for the human homolog. After collecting a wide range of SAXS data and numerous calculations, a plausible low resolution solution structure of human MFE-2 was obtained. The model reveals the overall assembly of the enzyme and the locations of the C-terminal SCP-2L domains (an unspecific lipid carrier), thus enabling further hypotheses regarding the possible role of the SCP-2L domain in the enzymatic reaction.


Tiivistelmä

Lipidit eli rasva-aineet ovat välttämättömiä eliöille ja niillä on lukemattomia rooleja mm. energianlähteinä, kalvojen rakenteina ja hormonien esiasteina. Rasvahappoja hajotetaan monivaiheisella metaboliareitillä, jota kutsutaan β-oksidaatioksi. Peroksisomaalinen rasvojen hajotusreitti on löydetty kaikista tähän asti tutkituista aitotumallisista, mutta mitokondrioissa tapahtuva rasvojen β-oksidaatio on löydetty vain nisäkkäiltä.

Peroksisomaalinen monitoiminen entsyymi tyyppi 2 (MFE-2) katalysoi toisen ja kolmannen reaktion R-spesifisellä rasvahappojen hajotusreitillä ja se on karakterisoitu useilta eri lajeilta. MFE-2 muodostaa lajista riippuen hyvin erilaisia ja molekyylimassaltaan erikokoisia alayksikköyhdistelmiä, jotka pystyvät katalysoimaan erityyppisten substraattien hapetuksen. Eri lajien MFE-2:n yksittäisten alayksiköiden kiderakenteet ovat olleet tunnettuja jo vuosia.

Tässä tutkimuksessa rakennetietämys laajenee MFE-2:n osalta alayksikkötasolta kokopitkän entsyymin tasolle, sillä banaanikärpäsen MFE-2:n (DmMFE-2) kiderakenne selvitettiin 2.15 ångströmin erotuskyvyllä. Tämä homodimeerinen entsyymi kantaa samassa polypeptidissä sekä 3R-hydroksiasyyli-KoA-dehydrogenaasi, että 2E-enoyyli-KoA-hydrataasi 2 -aktiivisuuksia. Kiderakenteen ja reaktiokinetiikan perusteella tehtiin johtopäätös, jonka mukaan DmMFE-2:n alayksiköt toimivat itsenäisinä kokonaisuuksinaan. Staattisen valonsironnan (SLS) ja röntgenpienkulmasirontamittauksien (SAXS) perusteella MFE-2:n erillisinä tuotetut alayksiköt eivät muodosta liuoksessa spontaanisti kokopitkän MFE-2:n kaltaisia oligomeerejä.

Ihmisen MFE-2:n alhaisen erotuskyvyn malli määritettiin röntgenpienkulmasirontatekniikan avulla. Tässä prosessissa käytettiin hyväksi banaanikärpäsen entsyymin tarjoamaa rakennetietoa, jonka perusteella rakennettiin ensin runko ihmisen MFE-2:lle. Monivaiheisen prosessin jälkeen saatiin lopulta laskettua vakuuttava malli, joka paljastaa ensimmäistä kertaa ihmisen kokopitkän MFE-2:n rakenteen ja antaa mahdollisuuden tehdä alustavia johtopäätöksiä karboksiterminaalisen lipidejä epäspesifisesti sitovan alayksikön (SCP-2L) biologisesta roolista osana tätä monitoimista entsyymiä.


Series: Acta Universitatis Ouluensis. A, Scientiae rerum naturalium
ISSN: 0355-3191
ISSN-E: 1796-220X
ISSN-L: 0355-3191
ISBN: 978-951-42-9606-2
ISBN Print: 978-951-42-9605-5
Issue: 582
Subjects:
Copyright information: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for your own personal use. Commercial use is prohibited.