|
|
Biochemical and biophysical studies on adenosine receptors and their interaction partners |
|---|---|
| Author: | Nanekar, Rahul1,2,3 |
| Organizations: |
1University of Oulu Graduate School 2University of Oulu, Faculty of Biochemistry and Molecular Medicine 3University of Oulu, Biocenter Oulu |
| Format: | ebook |
| Version: | published version |
| Access: | open |
| Online Access: | PDF Full Text (PDF, 11.3 MB) |
| Persistent link: | http://urn.fi/urn:isbn:9789526211022 |
| Language: | English |
| Published: |
Oulu : University of Oulu,
2016
|
| Publish Date: | 2016-02-19 |
| Thesis type: | Doctoral Dissertation |
| Defence Note: | Academic dissertation to be presented with the assent of the Doctoral Training Committee of Health and Biosciences of the University of Oulu for public defence in the Leena Palotie auditorium (101A) of the Faculty of Medicine (Aapistie 5 A), on 26 February 2016, at 12 noon |
| Tutor: |
Docent Veli-Pekka Jaakola |
| Reviewer: |
Doctor Simone Weyand Docent Tommi Kajander |
| Opponent: |
Docent Vesa Hytönen |
| Description: |
AbstractAdenosine receptors are heterotrimeric guanine nucleotide-binding (G protein)-coupled receptors (GPCRs) that mediate the effects of the endogenous agonist adenosine. The adenosine A₃ receptor (A₃R) is the least explored among the four human adenosine receptor subtype members (A₁, A2A, A2B and A₃) and it is implicated in both neuroprotective and neurodegenerative effects. During the course of this work, the production of the recombinant human A₃R in yeast and insect cells was evaluated and heteromerization between the human adenosine A2A receptor (A2AR) and the dopamine D₂ receptor (D₂R) was studied. A₃R with carboxyl-terminal GFP tag was expressed in the yeast Saccharomyces cerevisiae upto 15 mg per litre of culture. Another yeast Pichia pastoris increased the expression up to 108 mg/L of the same receptor when grown in bioreactors. Despite the very high expression levels, purification of A₃R from both yeasts was a daunting task, as the aggregation of the receptor could not be averted. In this study, insect cells have been found out to be more suitable host for A₃R expression: 10µg of the monomeric A₃R could be purified from one liter of insect cell culture. For successful crystallization thermostability of the A₃R was to be improved. This work has demonstrated that insertion of T4L, a fusion protein, in the third intracellular loop of A₃R increased the thermostability of the receptor by 10°C. As a next step, the combination of point mutations based on alanine-scanning mutagenesis and a fusion protein approach could be useful to stabilize and further crystallize the A3R. This work has demonstrated that the amounts of A3R expressed in insect cells and the final yield of the receptor isolated by affinity purifications, forms a good basis for the beginning of biochemical characterization. Receptor heteromerization is a mechanism used by GPCRs to diversify their signaling properties and functions. The human A2AR and D₂R heteromers exist in the GABAergic enkephalinergic neurons. The domains responsible for forming intermolecular contacts were purified from Escherichia coli (E. coli). Using biochemical/biophysical techniques such as native-PAGE and mass spectrometry, It was validated that purified carboxyl-terminus of the A2AR and the 3rd intracellular loop of D₂R form heterodimers. The investigation of purified calmodulin protein binding to the 3rd intracellular loop of D₂R showed that the protein-protein interactions are calcium dependent. see all
TiivistelmäAdenosiinireseptorit kuuluvat G-proteiinikytkeiset reseptorit (GPCR:t) proteiiniperheeseen. Adenosiinireseptorit välittävät endogeenisen ligandinsa adenosiinin vaikutuksia solukalvolta solunsisäisiin signaalijärjestelmiin. Adenosiini A₃ reseptori (A₃R) on adenosiinireseptorien neljästä alatyypistä (A₁, A2A, A2B ja A₃) vähiten tutkittu. Aikaisempien tutkimusten perusteella A3 reseptori yhdistetään sekä hermosoluja suojaaviin että rappeuttaviin tapahtumiin. Tässä työssä arvioitiin sekä ihmisen rekombinantti-A₃R:n tuottumista hiiva- ja hyönteissoluissa että tutkittiin ihmisen adenosiini A2A reseptorin (A2AR) ja dopamiini D₂ reseptorin (D₂R) heteromerisoitumista. Rekombinantti A₃ reseptori- vihreä fluoresoiva proteiini (GFP) fuusioproteiinia tuotettiin Saccharomyces cerevisiae -hiivassa 15 mg litrassa kasvatusliuosta. Pichia pastoris -hiivakanta taas kasvatti saman reseptorin tuottumista aina 108 mg/l saakka, kun tuotto tehtiin bioreaktorissa. Hyvin korkeasta tuottotasosta huolimattaA₃R:n puhdistus hiivasta oli ylitsepääsemätön tehtävä, sillä reseptorin saostumista ei voinut välttää. Työssä havaittiin, että hyönteissolut sopivat paremmin A₃R:n tuottoon: noin 10 µg monomeerista A₃R:a voitiin puhdistaa litran hyönteissoluviljelmästä. Reseptorin stabiilisuuden lisääminen helpottaa reseptorin biokemiallista ja biofysikaalista karakterisointia. Tässä työssä osoitettiin, että T4L-proteiinin lisääminen A₃R:n kolmannen solunsisäisen silmukan paikalle lisää reseptorin lämpöstabiilisuutta 10 °C. Jatkotutkimuksissa voitaisiin käyttää alaniiniskannausmutageneesiin perustuvien pistemutaatioiden ja fuusioproteiinin yhdistelmää A₃R:n lisästabilointiin ja kiteytykseen. Tämän työn perusteella määrät, joilla A₃R tuottuu hyönteissoluissa ja jotka saadaan eristettyä affiniteettipuhdistuksilla, muodostavat hyvän perustan proteiinin biokemialliselle karakterisoinnille. Reseptorin heteromerisoituminen on GPCR:en käyttämä mekanismi signalointiominaisuuksien ja toimintojen monipuolistamiseksi. Ihmisessä A2AR ja D₂R heteromeereja on GABAergisissä enkefalinergisissä hermosoluissa. Molekyylien välisiin kontakteihin osallistuvat domeenit puhdistettiin Escherichia coli (E. coli) -bakteerista. Biokemiallisia ja biofysikaalisia tekniikoita kuten natiivi-PAGE:a ja massaspektrometriaa käyttäen vahvistettiin, että puhdistettu A2AR:n karboksiterminaalinen osa ja D₂R:n kolmas solunsisäinen silmukka muodostavat heterodimeereja. Myös tutkittaessa puhdistetun kalmoduliini-proteiinin sitoutumista D₂R:n kolmanteen solunsisäiseen silmukkaan osoitettiin proteiini-proteiini -vuorovaikutuksen olevan kalsiumista riippuvainen. see all
|
| Series: |
Acta Universitatis Ouluensis. D, Medica |
| ISSN: | 0355-3221 |
| ISSN-E: | 1796-2234 |
| ISSN-L: | 0355-3221 |
| ISBN: | 978-952-62-1102-2 |
| ISBN Print: | 978-952-62-1101-5 |
| Issue: | 1342 |
| Subjects: | |
| Copyright information: |
© University of Oulu, 2016. This publication is copyrighted. You may download, display and print it for your own personal use. Commercial use is prohibited. |