Abstract

Rapid development of molecular methods has led to the identification of an increasing number of disease-causing genes and variants, but their molecular function is often unknown. However, understanding their role in normal physiology and in disease is essential for the development of treatment options. In vitro and in vivo disease models are important tools for biomedical research. In vivo models enable the study of physiological processes in the context of a whole animal. Among animal models, mouse is the most used, and has been widely utilised to understand human biology and disease.

In the current study, a novel rare multiorgan disease is characterised. Three patients with a previously undescribed early infantile-onset disease were discovered from two unrelated Finnish families. The patients presented with progressive cerebropulmonary and multiorgan symptoms leading to death before 2 years of age. The disease was named FINCA after its main histopathological findings: fibrosis, neurodegeneration, and cerebral angiomatosis. Whole-exome sequencing revealed hetero compound variants in a poorly characterised NHL repeat containing 2 (NHLRC2) gene of the patients. Both variants segregated from healthy heterozygous parents. Patient-derived skin fibroblasts showed a significant decrease in the amount of NHLRC2 protein.

Zebrafish and knockout and knockin (KI) mouse models were generated to study the molecular function of the disease-causing gene and the pathogenesis of the disease in vitro and in vivo. Complete loss of Nhlrc2 resulted in early embryonic lethality in mouse revealing an important role for the gene in early embryogenesis. Further analysis showed Nhlrc2 to be essential for completion of gastrulation but not for the viability of embryonic stem cells. The FINCA KI mouse model showed a consistent decrease in NHLRC2 but lacked a severe phenotype. However, studies of the mouse model revealed altered proteins associated with endo- and autolysosomal pathways, and RNA homeostasis in neuronal precursor cells and the brain.

The results presented in this thesis reveal NHLRC2 as a novel actor in neurodegeneration, fibrosis, and early embryogenesis. In recent years, NHLRC2 has also been associated with more common diseases, and future studies will determine its role in neurodevelopmental disorders, neurodegeneration, inflammation, fibrosis, and cancer.

Tiivistelmä

Molekyylibiologian menetelmien nopea kehittyminen on mahdollistanut uusien, toiminnaltaan tuntemattomien tautigeenien ja varianttien tunnistamisen. Geenin toiminnan ymmärtäminen normaalissa fysiologiassa ja taudissa on välttämätöntä, jotta hoitojen kehittäminen on mahdollista. In vivo- ja in vitro -tautimallit ovat tärkeitä työkaluja biolääketieteen tutkimuksessa. Eläinmallit mahdollistavat fysiologisten toimintojen tutkimuksen koko eläimessä. Hiiri on malleista käytetyin, ja sitä on käytetty laajalti ihmisen biologian ja tautien tutkimuksessa.

Tässä tutkimuksessa kuvattiin uusi, harvinainen monielintauti. Kolme potilasta, jotka olivat kahdesta suomalaisesta perheestä, sairastui ennestään tuntemattomaan tautiin ensimmäisten elinkuukausiensa aikana. Heille kehittyi etenevä keskushermosto- ja keuhko-oireisto sekä monielintauti, joka johti potilaiden menehtymiseen ennen kahden vuoden ikää. Tauti nimettiin FINCA-taudiksi kudostason päälöydösten eli fibroosin (fibrosis), hermostorappeuman (neurodegeneration) ja aivojen verisuonimuutosten (cerebral angiomatosis) mukaan. Koko eksomin sekvensointi paljasti potilailla yhdistelmän variantteja huonosti tunnetussa NHL repeat containing 2 (NHLRC2) -geenissä. Variantit periytyivät terveiltä heterotsygooteilta vanhemmilta. NHLRC2-proteiinin määrä oli merkittävästi alentunut potilaislähtöisissä fibroblasti-soluissa.

Taudin taustalla olevan geenin molekyylitason toimintaa ja FINCA-taudin etenemistä tutkittiin in vitro ja in vivo hyödyntäen seeprakalaa, Nhlrc2-poistogeenistä hiirtä ja luotua FINCA-hiirimallia. Poistogeeniset hiiret menehtyivät aikaisin alkionkehityksen aikana. NHLRC2 paljastui välttämättömäksi gastrulaatiolle, mutta ei alkion kantasolujen elinkyvylle. FINCA-hiirimallin kudosten NHLRC2-taso laski merkittävästi, mutta hiirelle ei kehittynyt vakavaa ilmiasua. Hiirimallin tutkimukset paljastivat kuitenkin muutoksia endo- ja autolysosomaalisiin reaktioreitteihin sekä RNA-homeostaasiin yhdistetyissä proteiineissa neuronien kantasoluissa sekä aivoissa.

Tutkimuksen tuloksena NHLRC2-proteiinin merkitys hermostorappeumassa, fibroosissa ja alkionkehityksessä tunnistettiin ensimmäistä kertaa. Jatkotutkimuksia kuitenkin tarvitaan selventämään NHLRC2:n merkitystä näissä ja viimevuosina geeniin liitetyissä yleisemmissä taudeissa, kuten aivojen kehityshäiriöissä, hermostorappeumissa, tulehduksissa, fibrooseissa ja syövissä.

Osajulkaisut / Original papers

Osajulkaisut eivät sisälly väitöskirjan elektroniseen versioon. / Original papers are not included in the electronic version of the dissertation.

1. Uusimaa, J., Kaarteenaho, R., Paakkola, T., Tuominen, H., Karjalainen, M. K., Nadaf, J., Varilo, T., Uusi-Mäkelä, M., Suo-Palosaari, M., Pietilä, I., Hiltunen, A. E., Ruddock, L., Alanen, H., Biterova, E., Miinalainen, I., Salminen, A., Soininen, R., Manninen, A., Sormunen, R., … Hinttala, R. (2018). NHLRC2 variants identified in patients with fibrosis, neurodegeneration, and cerebral angiomatosis (FINCA): characterisation of a novel cerebropulmonary disease. Acta Neuropathologica, 135(5), 727–742. https://doi.org/10.1007/s00401-018-1817-z

2. Hiltunen, A. E., Kangas, S. M., Ohlmeier, S., Pietilä, I., Hiltunen, J., Tanila, H., McKerlie, C., Govindan, S., Tuominen, H., Kaarteenaho, R., Hallman, M., Uusimaa, J., & Hinttala, R. (2020). Variant in NHLRC2 leads to increased hnRNP C2 in developing neurons and the hippocampus of a mouse model of FINCA disease. Molecular Medicine, 26(1), 123. https://doi.org/10.1186/s10020-020-00245-4

   Rinnakkaistallennettu versio / Self-archived version

3. Hiltunen, A. E., Vuolteenaho, R., Ronkainen, V., Miinalainen, I., Uusimaa, J., Lehtonen, S., & Hinttala, R. (2022). Nhlrc2 is crucial during mouse gastrulation. Genesis, 60(3). https://doi.org/10.1002/dvg.23470