University of Oulu

Survey of current high-throughput screening methods on living organisms and developing bioprocesses to establish a long term culture of nephron stem cells

Saved in:
Author: Karjalainen, Mikael1
Organizations: 1University of Oulu, Faculty of Technology, Environmental Engineering
Format: ebook
Version: published version
Access: open
Online Access: PDF Full Text (PDF, 5.4 MB)
Persistent link: http://urn.fi/URN:NBN:fi:oulu-201511042102
Language: English
Published: Oulu : M. Karjalainen, 2015
Publish Date: 2015-11-09
Physical Description: 134 p.
Thesis type: Master's thesis (tech)
Tutor: Taskila, Sanna
Reviewer: Röning, Juha
Taskila, Sanna
Seppo, Vainio
Timo, Pikkarainen
Description:
The knowledge of kidney development is limited and for example the formation of nephrons is not fully understood. Kidney research is ongoing constantly and advances in the different fields of technology have allowed deeper understanding to this subject. Molecular biology is a good example how the development of technology can change a whole branch of science. The study of regulatory networks in kidney development has helped kidney researchers to understand better nephrogenesis, although the cultivation of different kidney cells is challenging. High-throughput screening has become available to academic research. Anymore, it is not only available for pharmaceutical industry. This powerful tool have been harnessed for kidney research and its usefulness have been proved. The high-throughput screening could be used to study how nephrons are formed when the kidney is developing. High-throughput assays need cells in large quantities, but the study of nephrogenesis is impaired by poor cell culture systems which rely heavily on primary cells. Presumably, the nephrons are formed from stem or progenitor cells, but the cultivation of these nephron stem cells is not possible as long term cultures. The nephron stem cells can be isolated in many different ways for cultivation, but establishing a long term culture is not possible. The problem is how to cultivate the nephron stem cells for the high-throughput screening assays in large quantities. Protein coatings are well-known technique in cell cultures and the aim will be to test protein coatings on renal cells. In addition, a survey of high-throughput screening will be done and the survey focused to the high-throughput screening on living organisms. The kidney experiments are presented here as a case study. A clear trend was identified from the high-throughput screening and the conclusion was that the development of technology has led to a new way of doing high-throughput screening. Now, it is customary to measure multiple quantities at once. Today, technology allows multiple different measurements from one experiment which increases the productivity of high-throughput screening tremendously. This “new high-throughput screening” is termed as “high-content screening”. There is also ongoing research in microfluidics, cell arrays, and flow cytometry which aims to improve the high-throughput and the high-content screening assays. These technologies have not changed dramatically the screening, but they can improve throughput. The protein coating experiments were done by cultivating and imaging dissociated mouse metanephric mesenchyme cells. The cells of mice were cultivated in microtitre plates which had different protein coatings in different wells. Imaging was done with an automated IncuCyte ZOOMTM microscope. This showed that only commercial available BME was significantly promoting cells proliferation. The experiments did not reveal what cells were proliferating. For stem cell cultures, it was proposed that the long term culture of nephron stem cells could established by cultivating the nephron stem cells as organoid niches. Here, the BME could be useful, because it promotes the proliferation of metanephric mesenchyme cells.
see all

Tietämys munuaisesta on vaillinaista ja esimerkiksi nefronien muodostumista ei ymmärretä yksityiskohtaisesti. Tekniikan kehittyessä munuaistutkimus syventyy entisestään ja esimerkiksi molekyylibiologia on antanut paljon munuaistutkimukselle. Munuaisen solujen geenien säätelyn tutkiminen ja kartoittaminen on auttanut tutkijoita ymmärtämään paremmin nefronien kehitystä vaikka eri munuaissolujen viljely on haasteellista. Laajaseulonta eli ”high-throughput screening” on tullut akateemisen tutkimuksen saataville ja se ei ole enää vain lääketeollisuuden yksinoikeus. Muinuaistutkimuksessa on käytetty laajaseulontaa ja sen hyödyt ovat selvät. Laajaseulontaa voitaisiin käyttää kehittyvän munuaisen nefronien muodostumisen tutkimiseen, mutta munuaissolujen soluviljelmät ovat ongelmallisia kokeiden toteuttamiseen. Soluviljelmät muun muassa keskittyvät vahvasti primäärisoluihin. Oletettavasti nefronit muodostuvat kantasoluista tai jo vähän erilaistuneista kantasoluista. Näitä oletettuja soluja ei kuitenkaan pystytä tällä hetkellä viljelemään ja tutkimukseen käytetään paljon primäärisoluja. Soluja pystytään siis eristämään monella eri tavalla, mutta pidempiaikainen viljely ei onnistu. Ongelma on, kuinka viljellä paljon nefronien kantasoluja laajaseulonnan kokeisiin. Proteiinipäällystykset ovat hyvin tunnettu tekniikka soluviljelmissä ja tämän työn tavoite on testata eri proteiinipäällystyksiä soluviljelmissä. Lisäksi laajaseulonnan tilasta tehdään selvitys keräämällä tietoa alasta ja sen kehityksestä. Selvitys rajattiin suurimmaksi osaksi elävillä organismeilla tehtävään laajaseulontaan. Munuaisen solut ovat siis työssä mukana tapaustutkimuksena. Laajaseulonnassa on tapahtunut huomattava muutos ja tekniikan kehittyessä laajaseulonnassa ei enää keskitytä mittaamaan yhtä suuretta kerrallaan. Nykyään tekniikka mahdollistaa monen eri mittauksen tekemisen yhdestä kokeesta, mikä kasvattaa laajaseulonnan tuottavuutta paljon verrattuna aiempaan seulontaan. Englanniksi tämä uusi seulontatapa on ”high-content screening”. Myös mikrofluidiikassa, solusiruissa, ja virtaussytometriassa tehdään tutkimusta, jota voidaan hyödyntää laajaseulonnassa. Nämä teknologiat eivät ole muuttaneet merkittävästi laajaseulontaa, mutta niitä voidaan käyttää laajaseulonnan tehostamiseen. Proteiinipäällystyskokeet toteutettiin kasvattamalla ja kuvaamalla eristettyjä hiiren metanefrisen mesenkyymin soluja. Hiiren soluja kasvatettiin kuoppalevyillä joiden kaivoissa oli erilaisia proteiinipäällystyksiä. Kuvaaminen tehtiin IncuCyte ZOOMTM–laitteella. Kokeiden mukaan vain kaupallisesti saatava BME pystyi pidentämään merkittävästi hiiren solujen kasvatusta. Tutkimus ei paljastanut mitä soluja kuoppalevyillä kasvoi. Ratkaisuksi kantasolu viljelmille ehdotettiin organoideja. Organoideja voisi hyödyntää viljelemällä nefronien kantasoluja organoideina. Organoidit muodostaisivat kantasolutaskuja, joissa kantasolut voisivat elää niille sopivassa ympäristössä säilyen erilaistumattomina pitkään. Organoidien viljelyssä BME:stä voisi olla hyötyä, koska kokeissa metanefrisen mesenkyymin solut kasvoivat siinä.
see all

Subjects:
Copyright information: © Mikael Karjalainen, 2015. This publication is copyrighted. You may download, display and print it for your own personal use. Commercial use is prohibited.